(一）单管式三级发酵装置
1-主要部件①发酵瓶3只。用透明玻璃瓶，便于观察 液基情况，容积为0.1升、1升、10升各1只。也可用其他容量 的，但相邻级数瓶子的容积应呈5〜10倍放大。②棉塞3只。 用普通洁净新棉制成，大小和各瓶口径匹配。③过滤器1只。 用带有球径1.5厘米或2. 3厘米球形内腔，内管径1厘米的 玻璃管，在其球形内腔中以每立方厘米约1.4克的密度充填 普通未脱脂洁净新棉„也可参阅第三章制种技术中“液体菌种 制作”部分自制过滤器的方法制作。④导管（进气管）若干根。 用管径1厘米的玻璃管制成。⑤橡胶皮管若干段。管径1厘 米，起连接导管的作用，也具有启闭作用。⑥皮管夹4个。控 气控液用，选用金属质管夹。⑦增氧泵1只。采用空载气流量 每分钟大于1.5升的电磁泵。
2-安装方法在3个棉塞中分别各插人1根导管，然后 把棉塞分别塞入相应瓶口上；将各级导管与空气过滤器和增 氧泵相连接，然后在相应部位加上皮管夹（图19)。
3.注意事项
第一，各部件需抗腐蚀、无毒，经高温高压灭菌不变形。
第二，各部件间连接要密封牢固，防止漏气和杂菌感染。 各管道间的最后连接可以在接种箱内进行（要求严格消毒灭 菌），也可以在普通环境中利用酒精灯的火焰无菌区进行连接 操作。
第三，增氧泵的安放位置应略高于各级发酵瓶，以防培养 液倒流而损坏泵内部件。
二）液体培养基配方
配方1 葡萄糖30克，蛋白胨20克，磷酸二氢钾0.5 克，氯化钙2. 5克，水1 000毫升。pH值自然。
配方2 葡萄糖10克，酵母汁100毫升，磷酸二氢钾0. 5 克，硫酸镁0.2克，氯化钠（食盐）0. 2克，碳酸钙2克，水1000 毫升。pH值自然。
配方3 葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，磷酸 二氢钾0. 04克，硫酸镁0. 04克，食盐10克，维生素B, 200毫 克，水1 000毫升。pH值自然。
配方4 葡萄糖20克，酵母粉30克，蛋白胨10克，玉米 粉10克，黄豆粉10克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.3克，食 盐0. 3克，味精0. 1克，维生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH 值自然。
配方5去皮土豆300克（煮汁），葡萄糖10克，蛋白胨2 克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁1克，食盐1克，水1000毫升。 pH值自然。
配方6 去皮i:豆300克（煮汁），蚕蛹20克，氨基酸复 合粉5克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁1克，氯 化钙1克，水1 000毫升。pH值自然。
配方7 葡萄糖20克，酵母粉2克，玉米粉10克，黄豆 饼10克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克，维生素B, 200毫克， 水1 000毫升。pH值自然。
配方8 蔗糖（白糖）10克，玉米粉50克，磷酸二氢钾3 克，硫酸镁1.5克，维生素B, 50毫克，水1 000毫升。pH值自 然。
配方9 去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，磷酸二 氢钾3克，硫酸镁1. 5克，维生素战10毫克，水1 000亳升。pH 值自然。
配方10去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，玉米粉 30克，黄豆粉10克，酵母裔2克，磷酸二氢钾1. 5克，硫酸镁 0.5克，水1 000毫升。pH值自然制作时，先将黄豆粉与土豆同时下锅，煮15分钟再下玉 米粉，以免起糊影响过滤。
配方11 去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，蛋白胨 10克，水1 000毫升。pH值自然。
配方12 葡萄糖30克，蛋白胨20克，磷酸二氢钾0.5 克，食盐2.5克，水1 000毫升。pH值自然。
配方13 葡萄糖10克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾1克， 硫酸镁0.5克，孟加拉红3.3毫升，链霉素30毫克，水 1 000毫升。pH值自然。在各种成分溶于水后，加热至沸，再加人孟加拉红，灭菌 后待培养基冷却再加人链霉素。
配方14 玉米粉20克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵 母粉5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生素B, 15毫 克，水1 000毫升。pH值自然。
配方15 葡萄糖20克，黄豆粉10克，磷酸二氢钾3克， 硫酸镁0. 4克，食盐0. 3克，味精0. 1克.维生素B, 5片，水 1 000毫升。pH值自然。
配方16 葡萄糖30克，玉米粉10克，豆饼粉20克，酵 母粉5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，碳酸钙2克，水 1 000毫升。pH值自然。
配方17 去皮土豆200克（煮汁），蔗糖20克，蛋白胨 0.5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000毫升。pH值 自然。
配方18 去皮土豆200克（煮汁），蔗糖20克，磷酸二氢 钾3克，硫酸镁1.5克，维生素10毫克，增产灵0.5毫克， 水1 000毫升。pH值自然。
配方19 豆芽500克（煮汁），葡萄糖20克，蛋白胨0.5 克，牛肉膏0.5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000 毫升。pH值自然。
配方20 葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母裔1克，磷酸 二氢钾1克，硫酸镁0.5克，生长素5毫升，水1 000毫升。pH 值自然。
配方21 葡萄糖50克，水解乳蛋白10克，酵母裔1克， 磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，卵黄1克，生长素5毫升，水 1 000毫升。pH值自然。
配方22 废糖蜜50克，玉米粉20克，维生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH值自然。
配方23 蔗糖20克，玉米粉50克，花生饼粉50克，维 生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH值自然。
配方24 葡萄糖20克，蛋白胨4克，牛肉裔4克，磷酸 二氢钾1克，硫酸镁0. 5克，维生素B, 2毫克，水1 000毫升。 pH值自然。
配方25 去皮土豆300克（煮汁），蚕豆粉20克，蔗糖10 克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生索毫克，水 1 000毫升。pH值自然。
配方26 麦芽粉20克（煮汁），蛋白胨10克，蔗糖10 克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000毫升。pH值自 然。
配方27 米汤1 000毫升，葡萄糖10克，蛋白胨2克，牛 肉裔1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生索氏1毫克。 pH值自然。
说明：①为避免在培养过程中产生大量泡沫，在配制培 养基时，可加人0. 02%的食用植物油如芝麻油、花生油、豆 油、菜籽油等（1 000毫升溶液加人3〜4滴），也可到药店或化 工商店购买“泡敌”（学名为聚环氧丙烷甘油醚），加入量为 0. 06%(1 000毫升溶液加人0. 6毫升）,.作为消泡剂消泡。也 可以在产生气泡之后再加人灭菌的消泡剂。②一般情况下， 培养液粘度高，菌丝碎片小；粘度低，碎片大。为增加培养液的 粘度，可以加人适量的玉米粉。这样就能培养出小颗粒的菌丝 球，一旦接人固体培养基，分散度好，发育迅速，可促成在短时 间内出现子实体。除用玉米粉外，也可用淀粉糊精、藻酸等作 为增粘剂。增粘剂的使用浓度一般为〜3%。③使用中可 根据需要相应增大或缩小配方中的成分用量（配方中的各成
分用量是以1 000毫升溶液量为标准列出的，也可换箅成百 分比浓度来计算）。④本装置为一、二、三级密封连续培养装 置，可逐级扩大培养液体积。上述配方各级培养液通用。⑤上 述各配方既适用于蛹虫草菌液体培养，也适用于冬虫夏草菌 液体培养。
(三）装瓶灭菌
上述配方任选1种，配制培养液。培养液配好后灌入各级 发酵瓶，装量约为每瓶容积的70%为宜。然后将上述相关装 置连同3个发酵瓶一起放进蒸锅内进行常规灭菌处理。高压 灭菌（118千帕压力）需经历40分钟；常压灭菌（100 C)需要8 个小时。灭菌后冷却待用。
(四）接种培养
在接种箱（室）内，实施无菌操作，关闭夹管，在酒精灯火 焰上将各管道连接成三级密封管道系统。然后把菌种接人第 一级0. 1升发酵瓶内的培养液中。接固体菌种或液体菌种均 可，固体菌种用量为1 000毫升培养液接种1支试管母种，液 体菌种用量为5%〜15%(体积比）。
接种后在22C〜25C的条件下静止培养2天，经观察液 基正常，即可开始吹氧培养。吹氧时以每分钟0.1〜0.3升的 通气速率向培养液底部不超过1厘米处通气搅拌培养5〜7 天，温度条件同上。待看到直径0.3〜1毫米的菌丝球（片、 段）充满培养液，第一级菌种即已培养好。利用虹吸法（第一级 培养液抬髙，以手指交替挤出管中气体，形成负压而将前一级 培养液导引人后一级培养容器中）将第一级发酵瓶中的菌液 吸人第二级发酵瓶，吹氧2天（通氧速率增加到每分钟1升）， 用上述检验方法检验合格后，即用虹吸法将第二级发酵瓶中 的菌液吸入第三级发酵瓶，继续吹氣2〜4天（通氧速率增加到每分钟1.5〜2升），即告三级菌种完成。
说明：①通气量一般为1 ： 0.5〜1，即每分钟通入培养瓶 内的空气量为培养液体积的50%〜100%。可用皮管夹控制 通气量。如想更准确，可在增氧泵和过滤器之间安装一只空气 流量计。也可用土法检测通气量，具体方法为：将有刻度的盐 水瓶装入500毫升的水，插入一头连接气泵的皮管，用手指把 瓶口堵死，然后翻转瓶子，将瓶口浸入脸盆中的清水中，手指 松开，然后打幵气泵通气。使通气的空气将瓶中500毫升的水 全部排完，再计算一下用去的时间（以秒计），即可得知气泵每 分钟的通气量。计箅公式为：每分钟通气量（升）=60(秒）/[排 水时间（秒）X0.5(升）]。②吹氧操作时，要按下述方法进行： 吹第一瓶时把第二瓶、第三瓶截住（关闭皮管夹）；吹第二瓶时 把第一瓶、第三瓶截住；吹第三瓶时把第一瓶、第二瓶截住。 ③液体菌种制好后，应立即使用，不能久放。在常温下最长放 2〜7天。
1-主要部件①发酵瓶3只。用透明玻璃瓶，便于观察 液基情况，容积为0.1升、1升、10升各1只。也可用其他容量 的，但相邻级数瓶子的容积应呈5〜10倍放大。②棉塞3只。 用普通洁净新棉制成，大小和各瓶口径匹配。③过滤器1只。 用带有球径1.5厘米或2. 3厘米球形内腔，内管径1厘米的 玻璃管，在其球形内腔中以每立方厘米约1.4克的密度充填 普通未脱脂洁净新棉„也可参阅第三章制种技术中“液体菌种 制作”部分自制过滤器的方法制作。④导管（进气管）若干根。 用管径1厘米的玻璃管制成。⑤橡胶皮管若干段。管径1厘 米，起连接导管的作用，也具有启闭作用。⑥皮管夹4个。控 气控液用，选用金属质管夹。⑦增氧泵1只。采用空载气流量 每分钟大于1.5升的电磁泵。
2-安装方法在3个棉塞中分别各插人1根导管，然后 把棉塞分别塞入相应瓶口上；将各级导管与空气过滤器和增 氧泵相连接，然后在相应部位加上皮管夹（图19)。
3.注意事项
第一，各部件需抗腐蚀、无毒，经高温高压灭菌不变形。
第二，各部件间连接要密封牢固，防止漏气和杂菌感染。 各管道间的最后连接可以在接种箱内进行（要求严格消毒灭 菌），也可以在普通环境中利用酒精灯的火焰无菌区进行连接 操作。
第三，增氧泵的安放位置应略高于各级发酵瓶，以防培养 液倒流而损坏泵内部件。
二）液体培养基配方
配方1 葡萄糖30克，蛋白胨20克，磷酸二氢钾0.5 克，氯化钙2. 5克，水1 000毫升。pH值自然。
配方2 葡萄糖10克，酵母汁100毫升，磷酸二氢钾0. 5 克，硫酸镁0.2克，氯化钠（食盐）0. 2克，碳酸钙2克，水1000 毫升。pH值自然。
配方3 葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，磷酸 二氢钾0. 04克，硫酸镁0. 04克，食盐10克，维生素B, 200毫 克，水1 000毫升。pH值自然。
配方4 葡萄糖20克，酵母粉30克，蛋白胨10克，玉米 粉10克，黄豆粉10克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.3克，食 盐0. 3克，味精0. 1克，维生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH 值自然。
配方5去皮土豆300克（煮汁），葡萄糖10克，蛋白胨2 克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁1克，食盐1克，水1000毫升。 pH值自然。
配方6 去皮i:豆300克（煮汁），蚕蛹20克，氨基酸复 合粉5克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁1克，氯 化钙1克，水1 000毫升。pH值自然。
配方7 葡萄糖20克，酵母粉2克，玉米粉10克，黄豆 饼10克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克，维生素B, 200毫克， 水1 000毫升。pH值自然。
配方8 蔗糖（白糖）10克，玉米粉50克，磷酸二氢钾3 克，硫酸镁1.5克，维生素B, 50毫克，水1 000毫升。pH值自 然。
配方9 去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，磷酸二 氢钾3克，硫酸镁1. 5克，维生素战10毫克，水1 000亳升。pH 值自然。
配方10去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，玉米粉 30克，黄豆粉10克，酵母裔2克，磷酸二氢钾1. 5克，硫酸镁 0.5克，水1 000毫升。pH值自然制作时，先将黄豆粉与土豆同时下锅，煮15分钟再下玉 米粉，以免起糊影响过滤。
配方11 去皮土豆200克（煮汁），葡萄糖20克，蛋白胨 10克，水1 000毫升。pH值自然。
配方12 葡萄糖30克，蛋白胨20克，磷酸二氢钾0.5 克，食盐2.5克，水1 000毫升。pH值自然。
配方13 葡萄糖10克，蛋白胨5克，磷酸二氢钾1克， 硫酸镁0.5克，孟加拉红3.3毫升，链霉素30毫克，水 1 000毫升。pH值自然。在各种成分溶于水后，加热至沸，再加人孟加拉红，灭菌 后待培养基冷却再加人链霉素。
配方14 玉米粉20克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，酵 母粉5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生素B, 15毫 克，水1 000毫升。pH值自然。
配方15 葡萄糖20克，黄豆粉10克，磷酸二氢钾3克， 硫酸镁0. 4克，食盐0. 3克，味精0. 1克.维生素B, 5片，水 1 000毫升。pH值自然。
配方16 葡萄糖30克，玉米粉10克，豆饼粉20克，酵 母粉5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，碳酸钙2克，水 1 000毫升。pH值自然。
配方17 去皮土豆200克（煮汁），蔗糖20克，蛋白胨 0.5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000毫升。pH值 自然。
配方18 去皮土豆200克（煮汁），蔗糖20克，磷酸二氢 钾3克，硫酸镁1.5克，维生素10毫克，增产灵0.5毫克， 水1 000毫升。pH值自然。
配方19 豆芽500克（煮汁），葡萄糖20克，蛋白胨0.5 克，牛肉膏0.5克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000 毫升。pH值自然。
配方20 葡萄糖10克，蛋白胨10克，酵母裔1克，磷酸 二氢钾1克，硫酸镁0.5克，生长素5毫升，水1 000毫升。pH 值自然。
配方21 葡萄糖50克，水解乳蛋白10克，酵母裔1克， 磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，卵黄1克，生长素5毫升，水 1 000毫升。pH值自然。
配方22 废糖蜜50克，玉米粉20克，维生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH值自然。
配方23 蔗糖20克，玉米粉50克，花生饼粉50克，维 生素B, 100毫克，水1 000毫升。pH值自然。
配方24 葡萄糖20克，蛋白胨4克，牛肉裔4克，磷酸 二氢钾1克，硫酸镁0. 5克，维生素B, 2毫克，水1 000毫升。 pH值自然。
配方25 去皮土豆300克（煮汁），蚕豆粉20克，蔗糖10 克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生索毫克，水 1 000毫升。pH值自然。
配方26 麦芽粉20克（煮汁），蛋白胨10克，蔗糖10 克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1 000毫升。pH值自 然。
配方27 米汤1 000毫升，葡萄糖10克，蛋白胨2克，牛 肉裔1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，维生索氏1毫克。 pH值自然。
说明：①为避免在培养过程中产生大量泡沫，在配制培 养基时，可加人0. 02%的食用植物油如芝麻油、花生油、豆 油、菜籽油等（1 000毫升溶液加人3〜4滴），也可到药店或化 工商店购买“泡敌”（学名为聚环氧丙烷甘油醚），加入量为 0. 06%(1 000毫升溶液加人0. 6毫升）,.作为消泡剂消泡。也 可以在产生气泡之后再加人灭菌的消泡剂。②一般情况下， 培养液粘度高，菌丝碎片小；粘度低，碎片大。为增加培养液的 粘度，可以加人适量的玉米粉。这样就能培养出小颗粒的菌丝 球，一旦接人固体培养基，分散度好，发育迅速，可促成在短时 间内出现子实体。除用玉米粉外，也可用淀粉糊精、藻酸等作 为增粘剂。增粘剂的使用浓度一般为〜3%。③使用中可 根据需要相应增大或缩小配方中的成分用量（配方中的各成
分用量是以1 000毫升溶液量为标准列出的，也可换箅成百 分比浓度来计算）。④本装置为一、二、三级密封连续培养装 置，可逐级扩大培养液体积。上述配方各级培养液通用。⑤上 述各配方既适用于蛹虫草菌液体培养，也适用于冬虫夏草菌 液体培养。
(三）装瓶灭菌
上述配方任选1种，配制培养液。培养液配好后灌入各级 发酵瓶，装量约为每瓶容积的70%为宜。然后将上述相关装 置连同3个发酵瓶一起放进蒸锅内进行常规灭菌处理。高压 灭菌（118千帕压力）需经历40分钟；常压灭菌（100 C)需要8 个小时。灭菌后冷却待用。
(四）接种培养
在接种箱（室）内，实施无菌操作，关闭夹管，在酒精灯火 焰上将各管道连接成三级密封管道系统。然后把菌种接人第 一级0. 1升发酵瓶内的培养液中。接固体菌种或液体菌种均 可，固体菌种用量为1 000毫升培养液接种1支试管母种，液 体菌种用量为5%〜15%(体积比）。
接种后在22C〜25C的条件下静止培养2天，经观察液 基正常，即可开始吹氧培养。吹氧时以每分钟0.1〜0.3升的 通气速率向培养液底部不超过1厘米处通气搅拌培养5〜7 天，温度条件同上。待看到直径0.3〜1毫米的菌丝球（片、 段）充满培养液，第一级菌种即已培养好。利用虹吸法（第一级 培养液抬髙，以手指交替挤出管中气体，形成负压而将前一级 培养液导引人后一级培养容器中）将第一级发酵瓶中的菌液 吸人第二级发酵瓶，吹氧2天（通氧速率增加到每分钟1升）， 用上述检验方法检验合格后，即用虹吸法将第二级发酵瓶中 的菌液吸入第三级发酵瓶，继续吹氣2〜4天（通氧速率增加到每分钟1.5〜2升），即告三级菌种完成。
说明：①通气量一般为1 ： 0.5〜1，即每分钟通入培养瓶 内的空气量为培养液体积的50%〜100%。可用皮管夹控制 通气量。如想更准确，可在增氧泵和过滤器之间安装一只空气 流量计。也可用土法检测通气量，具体方法为：将有刻度的盐 水瓶装入500毫升的水，插入一头连接气泵的皮管，用手指把 瓶口堵死，然后翻转瓶子，将瓶口浸入脸盆中的清水中，手指 松开，然后打幵气泵通气。使通气的空气将瓶中500毫升的水 全部排完，再计算一下用去的时间（以秒计），即可得知气泵每 分钟的通气量。计箅公式为：每分钟通气量（升）=60(秒）/[排 水时间（秒）X0.5(升）]。②吹氧操作时，要按下述方法进行： 吹第一瓶时把第二瓶、第三瓶截住（关闭皮管夹）；吹第二瓶时 把第一瓶、第三瓶截住；吹第三瓶时把第一瓶、第二瓶截住。 ③液体菌种制好后，应立即使用，不能久放。在常温下最长放 2〜7天。
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